Преподобный Нил родился в одном селении Новгородской области, Деревской Пятины, Жабенского погоста. В1505 году он принял постриг в обители преподобного Саввы Крыпецкого близ Пскова. После 10 лет подвижнической жизни в киновии удалился на реку Серемлю, в сторону города Осташкова, где 13 лет вел строгую аскетическую жизнь в непрерывной брани с кознями диавола, которые выражались в явлениях призраков – гадов и диких зверей. Многие жители из окрестных мест стали приходить к преподобному за наставлениями, но он стал этим тяготиться и молить Бога указать ему место для подвига безмолвия. Однажды, после долговременной молитвы, Нил уснул и услыхал голос, повелевавший ему: «Нил! выйди отсюда и иди на остров Столобенский; там ты можешь спастись».
Получив сие повеление, преподобный исполнился великой радости, потому что видел, что Господь не презрел его молений. Нил начал расспрашивать об острове христолюбивых людей, приходивших к нему. Те поведали ему, что остров тот находится на озере Селигере, в семи верстах от города Осташкова, Тверской губернии. Преподобный отправился туда, достиг острова и был радостно поражен его красотой. В середине озера – покрытый густым лесом остров, на котором преподобный нашел небольшую гору и выкопал пещеру, а спустя некоторое время построил хижину, в которой и прожил 26 лет. Подвиги строгого постничества и безмолвия сопровождал еще и другим, особенным подвигом – никогда не ложился спать, а позволял себе лишь легкую дремоту, опираясь на крюки, вделанные в стену келлии.
Однажды в хижину ворвались грабители. Преподобный сказал им: «Все мое сокровище в углу келлии». Там стояла икона Богоматери. Разбойники стали искать деньги и ослепли. Тогда в слезах раскаяния стали они молить святого о прощении. Известны и многие другие чудеса, совершенные преподобным. Он безмолвно отказывался от приношений, если совесть у приходивших к нему была нечиста или они находились в нечистоте телесной.
В предчувствии кончины преподобный Нил приготовил себе гроб. А к самому времени преставления прибыл на остров игумен одного из близлежавших монастырей и приобщил его Святых Тайн. По уходе игумена преподобный Нил в последний раз совершил молитву, окадил святые иконы и келлию и предал Господу бессмертную свою душу 7 декабря 1554 года. Прославление его святых мощей (ныне почивающих в Знаменском храме г. Осташкова) совершилось в 1667 году с установлением празднования 27 мая и в день преставления.
Преподобный Нил Столобенский преставился 7 декабря 1554 года.
Позже на месте подвигов преподобного Нила возникла обитель, названная его именем. Иноками Оршина монастыря была написана икона преподобного Нила, на месте погребения святого стали совершаться чудесные исцеления больных. Впоследствии живший в обители святитель Нектарий, архиепископ Сибирский и Тобольский, решил построить каменный храм вместо прежнего, деревянного. Во время закладки фундамента земля осыпалась и открылись нетленные мощи преподобного Нила. Обретение мощей произошло 27 мая 1667 года, одновременно было установлено празднование преподобному в честь этого события.